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    公开号:WO1986006636A1
    申请号:PCT/JP1986/000247
    申请日:1986-05-15
    公开日:1986-11-20
    发明作者:Shigeru Kurooka；Shingo Hiroishi；Shigeyuki Matsuyama；Toshiaki Kaneko；Noriyuki Sunahara
    申请人:Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.；Shiraimatsu Shinyaku Co., Ltd.；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    [0001] 明 細
    [0002] モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体
    [0003] 技 術 分 野
    [0004] 本 発 明 は 抗 ヒ ト 降 型 - ア ミ ラ - ゼ モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 （ 以 下 、 抗 P - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 と い う ） ヒ ト 脬 型 な — ア ミ ラ - ゼ （ 以 下 、 P - A m y と い う ） の 定 量 法 お よ び P - A m y と ヒ ト 唾 液 腺 型 α - ア ミ ラ - ゼ ( 以 下 、 S - A m y と い う ） と の 分 離 法 な ら び に 分 離 用 試 薬 に 関 す る 。
    [0005] 背 景 技 術
    [0006] 血 清 の 如 き ヒ ト 体 液 中 の な - ァ ミ ラ - ゼ の 増 減 を 知 る こ と は 種 々 の 疾 患 、 特 に 膊 疾 患 の 診 断 に 有 用 で あ る の で a: ァ - ゼ の 測 定 は 高 頻 度 に 実 施 さ れ る 臨 床 検 査 項 目 の 一 つ と な っ て い る 。 ヒ ト な - ァ - ゼ に は 2 種 の ア イ ソ ザ ィ ム 、 す な わ ち P - A m y と S - A m y が 知 ら れ て お り 、 総 - ア ミ ラ - ゼ 活 性 を 測 定 す る だ け で は 正 確 な 診 断 が で き な い こ と も あ る の で 上 記 2 種 の ア イ ソ ザ ィ ム の 分 別 定 量 が 行 わ れ て い る 。 従 来 の 分 別 定 量 法 と し て は 、 例 え ば 電 気 泳 動 法 や 阻 害 法 な ど が あ る 。
    [0007] 電 気 泳 動 法 は 、 各 種 の 支 持 体 上 に 検 体 を ス ポ ッ ト し て 泳 動 を 行 い 、 分 離 し た ア イ ソ ザ ィ ム を 染 色 し 、 そ の 濃 さ か ら P - A m y と S - A m y の 活 性 を 知 る 方 法 で あ る 。 し か し 、 こ の 方 法 は 、 P - A m y と S - A m y の 分 離 が 完 全 で な い の で 正 確 な 分別定量 が で き な い 。 し か も 、 こ の 方 法 は 全操作 に 長 時 間 を 要す る の で 多 数 の 検'体 を 処 理 す る に は 全 く 不都合 で あ る 。.
    [0008] 一方、 阻 害法 は 、 小 麦 由 来 の S - A m y 阻 害剤 を 用 い そ の 阻害率 の 差 か ら S - A m y と P - A m y の 活性比 を 計 算 す る 方 法 で あ る 。 し か し 、 こ の 方法 は S - A m y に 対 す る 特異 的 阻 害度 が 低 い た め に 厳密 な 定 量—法 で あ る は い え な い 。 更 に こ の 方法 で は 阻 害剤 の 阻 害 度 に ロ ト 間 の 差 が あ る の で 標準 曲 線 を 作成 し な け れ ば な ら ず 、 そ の 作成 に 手 間 が か か る 。
    [0009] こ の よ う に 従 来法 は 迅速 性 、 定量 性 等 の 要 請 を 満足 す る も の で は な い 。
    [0010] と こ ろ で 、 P - A m y と S - A m y と は 極 め て 近 似 し た ア ミ ノ 酸配 列 を 有 す る こ と が 知 ら れ て お り 、 そ の 相 同 性 （ homology ) は 94 % に 達 す る こ と が 報 告 さ れ て い る [ ジ ー ン （ Gene) 28 263-270 ( 1984)]。 す な わ ち 両者 の ア ミ ノ 酸配列 の 違 い は 6 % に す ぎ な い 。 従 っ て 、 こ の よ う な P — A m y ま た は S - A m y に 対 す る モ ノ ク ロ — ナ ル 抗 体 は 、 こ れ ら 個 々 の 抗 原 の わ ず か な 違 い を 区別 し て 認 識 し 得 る も の で な け れ ば な ら な い 。 ま た S - A m y と 特異 的 に 結合 す る 抗 S - A m y モ ノ ク 口 - ナ ル 抗体 が 存 在す る 場 合 、 抗 P - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 が 認 識 す べ き ェ ビ ト - プ （ 抗原 決定基 ） は 更 に 狭 い 範 囲 か ら 選 択 さ れ な け れ ば な ら な い こ と に な る 。 こ の よ う に P - A m y と 特 異 的 に 結 合 す る 抗 P - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 を 得 る こ と は 極 め て 困 難 で あ る 。
    [0011] さ ら に 、 S - A m y は 市 販 さ れ て い る が P - A m y は 市 販 さ れ て い な い た め P - A m y の 入 手 は S - A m y の 場 合 よ り も 容 易 で な く 、 し か も 本 発 明 者 ら の 研 究 に よ れ ば フ ロ イ ン ド 完 全 ア ジ ュ バ ン ト と 共 に ヒ ト 脾 液 そ の も の を 動 物 に 投 与 し て も 十 分 免 疫 さ れ な い こ と が 見 い 出 さ れ た 。 以 上 の こ と は 抗 P - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 の 製 造 を よ り 一 層 困 難 な も の に し て い る 。
    [0012] な お 、 抗 S - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 を 用 い て S - A m y と P - A m y と を 分 離 し た 旨 の 報 告 が あ る が [ ザ ジ ャ ナ ル ォ ブ バ イ オ ケ ミ ス ト リ 一 ( J. B iocheia) 97
    [0013] (5) 1357- 1362( 1985)] 、 そ こ に は 主 と し て 抗 S - A m y モ ノ ク 口 - ナ ル 抗 体 に つ い て 記 載 さ れ て い る に す ぎ ず 、 抗 P - A m y モ ノ ク 口 - ナ ル 抗 体 産 生 細 胞 の ク 口 - ニ ン グ に 失 敗 し た 旨 が 報 告 さ れ て い る 。
    [0014] 発 明 の 開 示
    [0015] 本 発 明 の 目 的 は 、 特 異 性 が 高 く 、 そ し て P - A m y と S - A m y と の 分 別 定 量 に 有 用 な 抗 P - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 を 提 供 す る こ と に あ る 。
    [0016] 本 発 明 の 別 の 目 的 は 、 P - A m y の 定 量 法 ま た は P - A m y と S - A m y の 分 別 定 量 法 を 提 供 す る こ と に あ る 更 に 本 発 明 の 別 の 目 的 -は 、 P - A m y と S -一 A m y の 分 離 法 お よ び そ の た め の キ ッ ト を 提 供 す る こ と に あ る 。
    [0017] こ れ ら 、 な ら び に 他 の 本 発 明 の 目 的 は 、 以 下 の 記 述 に よ り 明 ら か に さ れ よ う 。
    [0018] 本 発 明 は 下 記 の 性 質 を有 す る 抗 P - A m y モ ノ ク 口 - ナ ル 抗 体 に 関 す る ： "
    [0019] <a> P - A m y を 認 識 す る 、 '
    [0020] <g> 実 質 的 に S - A m y を 認 識 し な い 、
    [0021] © 抗 原 た る P - A m y と の 免 疫 反 応 後 に お い て も 該 酵 素 が 失 活 し な い 。
    [0022] 本 発 明 の モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 は 、 細 胞 融 合 技 法 に よ り 製 造 で き る 。 更 に 詳 細 に は 、 本 発 明 の モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 は 次 の （1) 〜 （4) の 工 程 、 す な わ ち 、
    [0023] (1) 抗 原 な ら び に B 細 胞 調 製 工 程 、
    [0024] (2) 融 合 ♦ス タ リ - ユ ン グ * ク ロ - ユ ン グ 工 程 、
    [0025] (3) ハ イ プ リ ド - マ 培 養 工 程 、 お よ び
    [0026] (4) 必 要 に 応 じ て 行 わ れ る 精 製 工 程 、
    [0027] を 実 施 す る こ と に よ り 得 ら れ る 。 以 下 、 各 工 程 に つ い て 説 明 す る 。
    [0028] (1) 抗 原 な ら び に B 細 胞 調 製 工 程
    [0029] B 細 胞 は 、 抗 原 た る P - A m y で 十 分 免 疫 し た 動 物 の 脾 臓 よ り 採 取 で き る 。
    [0030] 抗 原 た る P - A m y は 高 純 度 の も の を 大 量 に 用 い る の が 最 も 好 ま し い 。 し か し 、 Ρ - A m y の 純 度 は— そ れ 程 高 い も の で な く と も 十 分 に 目 的 は 逹 成 で き る 。 例'え ば 、 ヒ ト 脬 液 の 部 分 精 製 物 が 抗 原 と し て 用 い ら れ る 。 ヒ ト 脬 液 か ら の P - A m y の 部 分 精 製 は 、 例 え ば 、 硫 安 分 画 法 に よ り 行 え る 。
    [0031] 免 疫 は 、 抗 原 た る P - A m y を マ ウ ス ゃ ッ ト の 如 き 哺 乳 動 物 に 投 与 す る こ と に よ り 行 え る 。 免 疫 条 件 、 例 え ば 抗 原 た る P - A m y の 使 用 量 、 投 与 部 位 、 ア ジ ュ バ ン ト の 種 類 や そ の 使 用 量 等 の 条 件 は 、 従 来 の 抗 血 清 を 得 る 場 合 の 条 件 が 採 用 さ れ る 。 通 常 、 免 疫 は 、 フ ロ イ ン ド 完 全 ア ジ ュ バ ン ト と P - A m y を 含 む 乳 阓 液 を マ ウ ス の 如 き 哺 乳 動 物 に 非 経 口 投 与 し 、 同 様 に し て 約 1 週 間 の 間 隔 を お い て 追 力 Π 免 疫 を す る こ と に よ り 行 わ れ る の 追 力 Q 免 疫 は 4 〜 7 回 行 わ れ る 。 最 終 免 疫 後 3 〜 5 日 に 十 分 免 疫 し た 哺 乳 動 物 の 脾 臓 か ら B 細 胞 を 採 取 す る 。
    [0032] (2) 融 合 ♦ ス ク リ - ユ ン グ ♦ ク ロ - ユ ン グ 工 程
    [0033] 融 合 は 、 融 合 促 進 剤 の 存 在 下 、 上 記 B 細 胞 な ら び に 公 知 の 骨 髄 腫 細 胞 （ 以 下 ミ ヱ 口 - マ 細 胞 と い う ） を 公 知 の 融 合 用 無 血 清 培 地 に 懸 濁 し 、 こ れ を 混 合 す る こ と に よ り 订 ん る 。
    [0034] 一 般 的 に ミ エ 口 - マ 細 胞 は 、 工 程 （1) で 用 い た 被 免 疫 動 物 と 同 種 の 動 物 由 来 の も の で あ っ て ハ イ プ リ ド - マ 選 択 培 地 で 生 育 で き ず 、 か つ 、 そ れ 自 身 が 抗 体 を 分 泌 し な い も の が 好 ま し い 。 こ の よ -う な ミ エ 口 — マ 細 胞 と— し て は 、 例 え ば 市販 さ れ て い る マ ゥ ス ミ ェ 口 - マ 細胞 P3- X63- Ag8- U1 あ る い は こ れ と 同 等物 が 挙 げ ら れ る 。
    [0035] 両細胞 の 混合比 は 、 通常 、 ミ ヱ 口 - マ 細 胞 1 に 対 し B 細胞 20で あ る 。 細胞 融合 促進剤 と し て は 、 例 え ば ポ リ ェ チ レ ン グ リ コ - ル が 用 い ら れ 、 分 子量 1 ,000〜 7，500 の も の が 好 ま し い 。 —
    [0036] 融合 細 胞 、 す な わ ち ハ イ プ リ ド - マ の 培 養 は 、 融合促 進剤 を 洗浄 除去 し ミ ヱ 口 - マ 細 胞用 培地 に 縣濁 し た ハ イ ブ リ ド - マ の 0.1〜 0.2 ず つ を 96穴 培 養 皿 （ 以 下 穴 と い う こ と も あ る ） に ま き 、 約 37。C に お い て 5 % 炭酸 ガ ス —空 気 中 で 温 置 す る こ と に よ り 行 え る 。 培養 中 、 HAT 培 地 の 如 き 公 知 の ハ イ プ リ ド - マ 選択 培地 を 添加 し 、 そ の 割 合 を 徐 々 に 高 め る の よ う な 培 地交 換 に よ り ハ イ ブ リ ド - マ 以 外 の 細胞 は 死滅 す る 。 最終 的 に は 同 様 に し て 再 び ハ イ プ リ ド - マ 選択培地 を ミ ヱ ロ - マ 細 胞用 培地 、 す な わ ち ハ イ プ リ ド - マ 用 培地 と 交 換 す る 。
    [0037] 目 的 と す る ハ イ プ リ ド - マ の ス ク リ - ニ ン グ は 、 培養 液 中 の 抗 体価 お よ び 交 差度 を 調 べ る こ と に よ り 行 え る 。 す な わ ち 、 培 養液 の 一部 に P - A m y ま た は S - A m お よ び 後述 の 不溶化第 二抗体 を 力 Π え て 温 置 し 、 遠 心 し 、 得 ら れ る ペ レ ツ ト 中 の 酵素活性 を 後述 の 定 量法 で 測 定 す る こ と に よ り そ の 抗 体価 お よ び P - A m y と S - A m y に 対 す る 交 差 の 程 度 を 知 る こ と が で き る 。 - ス ク リ - 二 ン グ し た /ヽ イ ブ リ ド - マ に つ い て 限 界 希 釈 法 を 適 用 す る に よ り 目 的 と す る 実 質 的 に P - A m の み を 認 識 す る ハ イ プ リ ド - マ が 創 製 で き る の ハ イ プ リ ド - マ は 锥 代 培 養 ま た は 凍 結 に よ り 半 永 久 的 に 保 存 で き る 。
    [0038] (3) ハ イ プ リ ド - マ の 培 養 工 程
    [0039] 前 工 程 で 得 た ハ イ プ リ ド - マ を ί π V r 0ま た は ί π v ivo で 培 養 す れ ば 目 的 の モ ノ ク 口 - ナ ル 抗 体 が 生 産 で き る 。
    [0040] ί π V ί t r 0で の 培 養 は 、 数 個 の ハ イ プ リ ド - マ の 96穴 培 養 皿 中 で の 培 養 か ら 始 め 、 徐 々 に ス ケ - ル ア ッ プ す る こ と に よ り 行 え る 。 ま た ί η ν ί νο で の 培 養 は 、 融 合 細 胞 の 増 殖 を 容 易 に さ せ る た め の プ リ ス タ ン （ pristane) 処 理 を し た マ ウ ス に ハ イ プ リ ド - マ を 腹 腔 内 に 接 種 す る こ と に よ り 実 施 で き 、 10〜 20日 後 に は モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 を 含 む 腹 水 が 蓄 積 さ れ る 。
    [0041] 一 般 に 、 i n v itro で の 培 養 は 高 純 度 の モ ノ ク ロ — ナ ル 抗 体 を 得 た い と き に 行 わ れ 、 in v ivo で の 培 養 は モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 を 大 量 に 得 た い と き に 行 わ れ る 。 通 常 ！ n v i vo で の 培 養 に よ り 、 マ ウ ス 1 匹 あ た り 10〜 ： lOOng の 抗 P - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 が 得 ら れ る 。 免 疫 分 析 に は ^ v ivo で の 培 養 で 蓄 積 さ れ た 腹 水 を そ の ま ま 利 用 す る こ と も で き る が 、 必 要 に 応 じ 更 に 精 製 し て も よ い - -
    [0042] (4) 精 製 工 程 一
    [0043] 必 要 に 応 じ て 行 わ れ る ί n v itro で の 培 養 物 ま た は in vivoの 培 養 で 蓄 積 さ れ た 腹 水 か ら の モ ノ ク 口 - ナ ル 抗 体 の 分 離 精 製 は 、 通 常 の 物 理 化 学 的 手 段 、 例 え ば 塩 析 ， 遠 心 分 離 ， 透 析 ， 不 溶 性 担 体 と 結 合 し て い る プ ロ テ イ ン A を 用 い る ァ フ ィ ニ テ ィ - ク ロ マ ト グ ラ フ ィ - の 如 き 各 種 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ - 等 の 手 段 を 合 ¾的 に 組 み 合 せ る こ と に よ り 行 え る 。
    [0044] か く し て 得 ら れ る 本 発 明 の 抗 P - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 は 、 P - A m y と S - A m y と を 確 実 に 識 別 で き る 。 ま た 、 P - A m y は 、 本 発 明 の モ ノ ク ロ — ナ ル 抗 体 と の 免 疫 反 応 後 に お い て も 、 低 分 子 の P ニ ト ロ フ ル マ ル ト へ プ タ オ シ ド （ 以 下 PNP と い う ） （ ベ - リ ン ガ - マ ン ハ イ ム GnbH ) や 高 分 子 の 不 溶 性 青 色 デ ン プ ン ポ リ マ - ( 第 一 化 学 薬 品 株 式 会 社 ） の 如 き 種 々 の 分 子 量 の 基 質 を 分 解 す る こ と が で き る 。
    [0045] 本 発 明 の モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 は P - A m y と S - A m y の 分 別 定 量 用 試 薬 と し て 有 用 で あ る 。
    [0046] P - A m y の 定 量 は 、
    [0047] ① 検 体 に 本 発 明 の モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 を 加 え て '温; 置 す る 工 程 （ 免 疫 反 応 工 程 ） 、
    [0048] ② 生 成 す る 抗 原 抗 体 複 合物 と そ れ 以 外 の'も の を 分 離 （ 通 常 遠 心 分 離 ） す る 工 程 （ 抗 原 抗 体 複 合 物 分 離 工 程 ） 、 お よ び - ③ 分 離 し た 抗 原 抗 体 複 合 物 （ 通 常 沈 殿 ） '中 の α - ア ミ ラ - ゼ 活 性 を 測 定 す る 工 程 （ - ア ミ ラ - ゼ 測 定 工 程 ） 、
    [0049] を 実 施 す る こ と に よ り 行 え る の よ う に 本 発 明 方 法 で は 直 接 P - A m y の 活 性 を 知 る こ と が で き る 。
    [0050] P - A m y と S - A m y と の 分 別 定 量 は 、 '前 記 ② の ェ 程 で 分 離 し た 抗 原 抗 体 複 合 物 お よ び そ れ 以 外 の も の （ 通 常 は 上 清 ） の な - ア ミ ラ - ゼ 活 性 を 測 定 す る と か 、 別 に 求 め た 総 - ァ ミ ラ - ゼ 活 性 か ら 上 記 の 方 法 に よ り 求 め た P - A m y の 活 性 を 差 し 引 く こ と に よ り 実 施 で き る 。
    [0051] P - A m y の 定 量 工 程 ① 〜 ③ は 、 す べ て 約 37て 前 後 で 行 わ れ る 。 工 程① に お け る 抗 P - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 は 一 般 に 、 検 体 中 の P - A m y に 対 応 す る 量 よ り も 過 剰 に 用 い ら れ る 。 工 程 ② は 、 ェ ン ザ ィ ム ィ ム ノ ア ツ セ ィ 法 に お け る B/F 分 離 の 技 術 を 応 用 す る こ と に よ り 行 え る 。 例 え ば 工 程① に お い て 抗 P — A m y モ ノ ク ロ — ナ ル 抗 体 の 代 わ り に 不 溶 化 抗 P - A m y モ ノ ク 口 - ナ ル 抗 体 を 用 い 免 疫 反 応 後 に 抗 原 抗 体 複 合 物 を 遠 心 分 離 す る と か 、 抗 原 抗 体 複 合 物 に 対 す る 抗 体 を 不 溶 化 し た も の 、 す な わ ち 不 溶 化 第 二 抗 体 を 工 程 ② に お い て 更 に 反 応 せ し め 生 ず る 複 合 物 を 遠 心 分 離 す る こ と に よ り 行 え る 。 こ こ に お け る 抗 体 の 不 溶 化 は 、 常 法 に よ り 不 溶 性 担 体 と 抗 P - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗体 も し く は 第 二 抗 体 を 結 合 さ せ る こ と に よ り 行 え る 。 不 溶 性 担 体 と し て は 公—知 の も の が い ず れ も 使 え る が 、 米 国 特 許 第 4， 166 , 767 号 記 載 の 細 菌 細 胞 壁 片 が 好 ま し く 用 い ら れ る 。 工 程 ③ お よ び 総 - ァ ミ ラ - ゼ 活 性 の 測 定 は 公 知 の 方 法 、 例 え ば 市 販 さ れ て い る - ア ミ ラ - ゼ 定 量 用 キ 'ソ ト を 用 い る と に よ り 実 施 で き る 。 そ の よ う な キ ツ ト の 例 と し て は べ - - リ ン ガ - マ ン ハ イ ム - 山 之 内 株 式 会 社 か ら 発売 さ れ て い る ォ - ハ " ッ ク ー ァ フ ゼ キ ッ 卜 が 挙 げ ら れ る の キ ッ ト で は PNP お よ び - グ ル コ シ ダ - ゼ を 含 む 溶 液 （以 下 PNP 試 薬 と い う ）を 基 質 と し て 用 い て い る 。
    [0052] P - A m y と S - A m y を 分 離 す る 試 薬 は 市 販 さ れ て い る 綏 て の な - ァ ミ ラ - ゼ 定 量 用 キ 'ソ ト と 任 意 に 組 み 合 わ せ る こ と が で き る 。 P - A m y と S - A m y と を 分 離 す る た め の 本 発 明 の 試 薬 は 、 少 く と も
    [0053] (1) 不 溶 性 担 体 と 結 合 し た 抗 P - A m y モ ノ ク 口 - ナ ル 抗 体 、 ま た は
    [0054] (2) ⑤ 抗 P - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 お ょ ぴ ® 不 溶 性 担 体 と 結 合 し た 第 二 抗 体 （ 不 溶 化 抗 体 ）
    [0055] を 含 む も の で あ る の 試 薬 に は 更 に 緩 衝 剤 、 防 腐 剤 、 安 定 化 剤 、 賦 形 剤 等 が 含 ま れ 得 る 。 上 記 （2) の 場 合 に は キ
    [0056] 'ン の 形 に す る の が 好 ま し い 発 明 を 実 施 す る た め の 最 良 の 形 態
    [0057] 次 に 実 施 例 を 挙 げ て 本 発 明 を 更 に 詳 細 に 説 明'す る 。 な お 、 以 下 で は 次 の 培 地 を 用 い た 。
    [0058] ① 細 胞 融 合 用 無 血 清 培 地 、 す な わ ち RPM1 1640 培 地 ( ギ ブ コ ラ ボ ラ ト リ ー ）
    [0059] ② ミ エ ロ - マ 細 胞 （ ま た は ハ イ プ リ ド - マ ） 用 培 地
    [0060] 上 記 ① 培 地 に 以 下 の も の を 添 加 し た 培 地 。
    [0061] 10 % ゥ シ 胎 児 血 清 （ F C S)、
    [0062] 4 DM グ ル タ ミ ン 、
    [0063] 50〃 M JS - メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル 、
    [0064] 100U/ B ぺ ニ シ リ ン G 、 お よ び
    [0065] 100 ^ g/i ス ト レ プ ト マ イ シ ン 。
    [0066] ③ HAT培 地 （ ハ イ プ リ ド - マ 選 択 培 地 ）
    [0067] 上 記 ② 培 地 に 以 下 の も の を 添 加 し た 培 地 。
    [0068] 0.1 ID ヒ ポ キ サ ン チ ン 、
    [0069] 0.4 M ア ミ ノ ブ テ リ ン 、 お よ び
    [0070] 16 M チ ミ ジ ン 。
    [0071] ま た 、 以 下 で は リ ン 酸 緩 衝 液 は P B S と 、 牛 血 清 ア ル ブ ミ ン は B S A と 略 称 す る 。
    [0072] 実 施 例 1 抗 P - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 の 製 造
    [0073] (1) ハ イ プ リ ド - マ の 創 製
    [0074] 抗 原 な ら び に 細 胞 の 調 製
    [0075] 4 。C に お い て ヒ ト 瞵 液 2 π ^ に 硫 安 554 ta を 力 Π え （ 飽 和 度 45 % ) 、 0 °C で 3 時 間 放 置 、 生 ず る ペ レ— ツ ト を 遠 心分離 （ 5000 X g 、 30分 ） し 、 こ の ペ レ ツ ト を 生 理食 塩 水 0.5IB ^ に 溶解す る 。
    [0076] こ の 溶液 に 等量 の フ ロ イ ン ド 完全 ア ジ ュ バ ン ト （ 半井 化学薬 品 株式 会 社 ） を 加 え て 乳化 し た も の 0.5π ^ を BAL.B/ c マ ウ ス （ 静 岡 実験動 物 協 同 組合 ） の 腹 腔 内 に 投与 し 、 1 週 間 後 に 同 様 に し て 免疫 す る 。 更 に 1 週 間 後 に 追 加 免 疫 （ 静注 ） し 、 以 後 同 様 に 6 回 の 追 加 免疫 を 行 い 3 日 後 に 脾臓 を 取 り 出 し て B 細 胞 を 採取す る 。
    [0077] ス ク リ ー ニ ン グ_*_ク_口 - _ニ ン _グ
    [0078] 対数増 殖期 に あ る マ ウ ス ミ エ 口 — マ 細胞 P3-X63-Ag8-Ul ( ATGC カ タ ロ グ 番号 CRL 1597 ) の 1 X 107 個 と 脾臓 細 胞 の 1 X 10 8 個 を 混 合 し 、 ①培地 で 遠心 00 X g： 、 10 分 ） 洗浄後 37 に 保温 し た 50% ポ リ エ チ レ ン グ リ コ - ル 1500 ( 和 光純薬工 業株式 会社 ） 1 m ^ を 1 分 間 か け て 加 え 、 ゆ っ く り 撹拌 す る 。 1 分後 、 37eC に 保温 し た 1 B の ①培地 を 同 様 に し て 加 え る 。 更 に 20 B の ① 培地 を 30秒 毎 に 1 π ず つ 加 え た 後 、 遠心 （ 400 X g 、 10分 ） し 上清 を 除 去 す る 。 得 ら れ る ペ レ ツ ト に 12 π の ② 培地 を 徐 々 に 加 え る 。 こ の 0.1 m ^ ず つ を 96穴培 養皿 に ま き 、 37 に お い て 5 % 炭酸 ガ ス 一空気 中 で 培 養 す る 。 20時 間 後 、 ③ 培 地 0.1 m ず つ を 穴 に 加 え る 。 2 日 、 3 日 、 5 曰 、 8 日 、 11日 、 13日 お よ び 15日 後 の 計 7 回 に わ た っ て Ο . Ι Η ^ の 培 地 を 捨 て 新 し い ③ 培-地 O. lB を 加 え る 。 乙 の 培 地 交 換 に よ り ハ イ プ リ ド - マ 以 外 の 細 胞 は 死 滅 す る 。 16日 以 降 は 再 び ② 培 地 に 交 換 し 、 培 養 す る 。 培 養 開 始 後 7 曰 目 に ハ イ プ リ ド - マ の 生 育 が 始 り 、 15日 目 に は 80% の 穴 に 生 育 が 認 め ら れ る 。
    [0079] 抗 体 価 お よ び 交 差 度 の 検 定
    [0080] 培 養 15日 後 の 培 養 液 の 抗 体 価 お よ び 交 差 度—を 次 の よ う に し て 調 べ た 。
    [0081] 定 用 試 薬
    [0082] (1) P - A m y 溶 液
    [0083] 降 液 250 ^ （ 92,000 IU/ ） を 下 記 緩 衝 液 A で 希 釈 し 、 全 量 を 50n ^ と な し た も の 。
    [0084] (2) S - A m y 溶 液
    [0085] 1 n の S - A m y ( シ グ マ ケ ミ カ ル Co. ) を 下 記 緩 衝 液 A で 溶 解 · 希 釈 し 全 量 を 50u ^ と な し た も の 。
    [0086] (3) 緩 衝 液 A ( p H 7.0 )
    [0087] 0.1 % B S A - 0.9% NaC 1 - 0.04 M P B S ( pH7.0 ) か ら な る 緩 衝 液 。
    [0088] (4) 不 溶 化 第 二 抗 体 の 懸 m液
    [0089] 米 国 特 許 第 4, 166,767 号 明 細 書 の 実 施 例 1 の 方 法 に よ り 調 製 し た も の 。 す な わ ち 、 ラ ク ト バ チ ル ス プ ラ ン タ ル ム ATCC 8014 の 細 胞 壁 片 125 ngを 水 2.5υ に 懸 蜀 し 、 こ れ に マ イ ル ス - イ エ ダ L t d * 社 製 の 抗 マ ウ ス I g G ゥ サ ギ 抗 体 溶 液 [ タ ン パ 25ig / 0.05M — P B S ( p H 7.0) 2.5 B ] 、 水 2.5 is お よ び 0.1 M — P B S ( p H 7.0 ) 2.5ia を 加 え て よ く 混 和 す る 。 こ れ に 撹 拌 下 2.5% の グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ド 溶 液 2.5 π を 滴 下 す る 。 1 時 間 撹 拌 後 、 遠 心 （ 2,000 X g . 10分 ） し 、 沈 殿 を 5 の
    [0090] 0.9% NaC 1 - 0.02M ト リ ス 緩 衝 液 （ P H 7.0 ) で 3 回 洗 ί争 し 、 目 的 と す る 不 溶 化 第 二 抗 体 を 得 る 。— こ れ を 5.2 in の 0.2 % B S A - 0.9% NaC 1 - 0.1% NaN3 ト リ ス 緩 衝 液
    [0091] ( H 7.0 ) に 懸 濁 し 、 さ ら に 超 音 波 処 理 を す る 。
    [0092] 検 定 操 作
    [0093] 抗 体 価 は 次 の よ う に し て 検 定 し た 。
    [0094] す な わ ち 、 ノヽ ィ プ リ ド ー マ 培 養 液 50 β 、 Ρ - A m y 溶 液 25 不 溶 化 第 二 抗 体 懸 蜀 液 50 を 混 合 し 、 37て で 30分 間 温 置 後 、 4 B ^ の 生 理 食 塩 水 を 加 え 遠 心 （ 3000 X g 、 5分 ） し て 上清 を す て る 。 ペ レ ツ ト に PNP 試 薬 I B ^ を 加 え 撹 拌 後 37 て で 温 置 す る 。 30分 後 、 2 π ^ の 反 応 停 止 液 [0.1 M - P B S ( p H 11)] を 力 Π え て 遠 心 し 、 上 清 の 吸 光 度 （ 405 ππ) を 測 定 す る 。 吸 光 度 が 高 い 穴 に 高 抗 体 価 を 有 す る 抗 P - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 が 含 ま れ て い る と 判 定 し た 。
    [0095] 交 差 度 は 、 抗 体 価 が 高 い 培 養 液'に つ い て 検 討 し た 。 す な わ ち 、 P - A m y 溶 液 の 代 わ り に S - A m y 溶 液 を 用 い る ほ か は 抗 体 価 検 定 の 場 合 と 同 じ 操 作 に よ り 交 差 度 を 検 定 し た 。 405 Π Βに お け る 吸 光 度 が 低 い 槟体 ほ ど 交 差 度 が 低 い と 判 定 し た 。
    [0096] 特 に 抗 体 価 が 高 く 、 か つ 、 交 差 度 が 低 い 抗 P - A m y モ ノ ク 口 - ナ ル 抗 体 産 生 株 を 選 び 、 96穴 培 養 皿 に 1個 /穴 に な る よ う に ハ イ プ リ ド - マ を ② 培 地 で 希 釈 し 、 培 養 す る 。 こ の よ う な 限 界 希 釈 培 養 を く り か え す こ と に よ り ク ロ ー ニ ン グ を 行 い 、 目 的 の ハ イ ブ リ ド — を 得 る 。
    [0097] こ の ハ イ プ リ ド - マ は 凍 結 ま た は 继 代 培 養 に よ り 保 存 で き る 。
    [0098] (2) モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 の 製 造 予 め プ リ ス タ ン （ pr istane) 0.5 π ί を 腹 腔 内 投 与 し た BALB/c マ ウ ス の 腹 腔 内 に 、 前 項 で 得 た ノ、 イ ブ リ ド - マ 1 X 10 7 個 を 接 種 す る 。 15日 目 に 目 的 と す る モ ノ ク 口 - ナ ル 抗 体 を 含 む 腹 水 3 u Z マ ウ ス を 得 る 。 次 に 4 °C に お い て 、 腹 水 に 等 量 の 飽 和 硫 安 溶 液 を 加 え 30分 間 撹 拌 後 、 遠 心 （ 5000 X s 、 30分 ） し 上 清 を す て る 。 ペ レ ツ ト を 0.05 M — P B S ( p H 7.4 ) - 0.14 M 塩 化 ナ ト リ ゥ ム 溶 液 に 溶 解 す る 。 こ れ を 4 。C で 一 夜 透 析 し 、 遠 心 （ 5000 X 、 30分 ） し 、 上 清 を 凍 結 乾 燥 し て 目 的 の 粗 モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 を 得 る 。
    [0099] 免 疫 拡 散 法 に よ る 検 定 に よ れ ば 、 こ の モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 は 、 I g G 1 サ ブ ク ラ ス に 属 し 、 そ の L 鎮 は カ ッ パ - に 属 す る も の で あ っ た 。 実 施例 2 ' 分 別 定 量 -
    [0100] P - A m y と S - A m y を 等量含 む 溶液 を 倍数希 釈 し た も の を 検 体 と し 、 以 下 の 方法 に よ り 分 別定量 を 行 う 。
    [0101] 総 な - ア ミ ラ - ゼ 活 性 の 定量
    [0102] 検 体 25 ί に ΡΝΡ試薬 1 D ^ を 力 Π え 37eC で 温 置 し 、 30分 後、 2 IB ^ の 0.1M - P B S ( p H 11 ) ( 反応停 止液 ） を 加 え 405 rim に お け る 吸光度 を 測 定 す る 。
    [0103] P - A m y の 定 量
    [0104] 検 体 25^ ^ 、 抗 P - A m y モ ノ ク ロ — ナ ル 抗体 [ 実施 例 1 の （2)項 で 得 た 腹水 を 緩 衝 液 A で 1000倍希釈 し た も の ] 50 お よ び 不 溶化第二抗体 懸濁 液 50 を 混合 し 37 'C で 温 置 し 30分 後 に 生理食塩 水 4 u を 加 え て 遠 心 （ 3000 X g 、 5 分 ） す る 。 得 ら れ る ペ レ ッ ト に PNP 試薬 In を 加 え 37 eC で 温 置 し 、 30 分 後 、 2 m の 反応 停止液 を 加 え 、 不溶 化第 二抗 体 を 遠 心分 離 （ 3000 X g： 、 5 分 ） し 、 そ の 上 清 に つ い て 405 n is に お け る 吸 光度 を 光路 1 cm の キ ュ べ ッ ト 中 で 測 定 す る 。
    [0105] S - A m y の 算 出
    [0106] 総 - ア ミ ラ - ゼ 活 性 か ら P - A m y 活性 を 差 し 引 い た も の を S - A m y 活性 と し た 。
    [0107] 疋 里 -果
    [0108] 第 1 表 に 定量結果 を 示 す 。 第 1 表
    [0109] 希釈倍数 P -Amy活性 （a) S - Amy活性（b) b/a
    [0110]
    [0111] 1 0.800 0.801 1.00
    [0112] 2 0.415 0.401 0.97
    [0113] 4 0.200 0.203 1.02
    [0114] 8 0.100 0.101 1.01
    [0115] 16 0.051 0.048 0.94
    [0116] 32 0.024 0.025 1.04
    [0117] 64 0.011 0.012 1.09
    [0118] 第 1 表 に 示 す よ う に P - A m y と S - A m y と の 比 - す な わ ち b a は 常 に ほ ぽ 1.00 で あ り 、 本 法 は 両 者 の 分 別 定 量 法 と し て 極 め て 優 れ て い る 実 施 例 3 分 別 定 量
    [0119] P - A m y > S - A m y お よ び 両 者 の 混 合 物 （ 混 合 比 は 後 記 第 2 表 に 示 す ） を 検 体 と し 、 以 下 の 方 法 に よ り 分 別 定 量 を 行 い 第 2 表 に 示 す 結 果 を 得 た 総 a — ァ - ゼ 活 性 の 定 量
    [0120] 40〃 ^の 検 体 に 緩 衝 液 A の 150 ^ を 力 B え 37 eC で 10分 間 温 置 す る 。 そ の 25 ^を と り 、 こ れ に PNP 試 薬 l m を 力 Π え 37 'C で 温 置 し 30分 後 、 2 π の 反 応 停 止 液 を 力 Π え 405nn に お け る 吸 光 度 を 光 路 1 cm の キ ュ べ ッ ト 中 で 測 定 す る 。
    [0121] S - A m y の 定 量 40 の 検体 に 、 抗体価検定 の 項 で 述 べ た の-と 同 じ 方 法 で 調 製 し た 不 溶 化 抗 P - A m y モ ノ ク 口 - ナ ル 抗 体 懸 蜀 液 150
    [0122] 5 分 ） す る 。 上清 の 25 を と り 、 れ に PNP 試薬 1 H を 力 Π え 37 eC で 温 置 し 、 30 分 後、 2 m ^ の 反 応 停止 液 を 加 え 405nm に お け る 吸 光度 を 光路 1 cm の キ ュ べ ツ ト 中 で 測 定 す る 。
    [0123] 定 量結 果
    [0124] 第 2 表 に 定量結果 を 示 す
    [0125] 第 2 表 検 体 総な -アミラ -t'活性（a) 上清活性 (b〉** b/a
    [0126] (OD/m^) (OD/ui)
    [0127] (1) P - Amy 0.165 0 0.00
    [0128] (2) S - Amy 0.372 0.375 1.01
    [0129] (3) S + P* 0.550 0.370 0.67
    [0130] [S/ (P+S) =0.7]
    [0131] (4) P - A m y 0.344 0 0.00
    [0132] (5) S - Amy 0.330 0.332 1.01
    [0133] (6) S + P 0.660 0.337 0.51
    [0134] [S/(P+S) = 0.5]
    [0135] (7) P - Amy 0.413 0 0.00
    [0136] (8) S - Amy 0.179 0.173 0.97
    [0137] (9) S + P 0.619 0.180 0.29
    [0138] [S/(P+S)=0.3]
    [0139] *P - Amyと S - Amyの混合物。 この場合、 総 -アミ ラ -ゼ （P + S) と S - A m yの比 [ S （ P + S )]が 0.7なるように混合した。—以下同様。
    [0140] **S - Amy活性に相当。 - .
    [0141] 検 体 中 の P - A m y は 不 溶 化 抗 P - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 に よ っ て 系 か ら 沈 殿 と し て 除 か れ て い る 。 従 つ て 、 第 2 表 に 示 す よ う に P - A m y の み を 含 有 す る 検 体 (1)、 （4)お よ び （7) の （ b ) 値 （ S - A m y 活 性 に 相 当 ） は 総 て ほ ぼ ゼ ロ で あ る 。 一 方 、 S - A m y は 系.か ら 除 か れ な い の で S - A m y の み を 含 有 す る 検 体 （2")、 （5)お よ び （8) の （ b ) 値 （ S - A m y 活 性 に 相 当 ） は 、 （ a ) 値 （ 総 な - ア ミ ラ - ゼ 活 性 ） と ほ ぼ 等 し い 。 ま た 第 2 表 に 示 す よ う に P - A m y と S - A m y の 混 合 比 [ P Z ( P + S ) ] と b / a の 値 は ほ ぽ 一 致 し て い る 。 こ の よ う に 本 法 の 分 別 定 量 法 は 極 め て 優 れ て い る 。
    [0142] 実 施 例 4 ヒ ト 血 清 の 分 別 定 量
    [0143] 膝 疾 患 々 者 お よ び 健 常 人 の 血 清 を 検 体 と し 、 実 施 例 2 と 同 様 に し て P - A m y の 定 量 を 行 い 第 3 表 の 結 果 を 得 た 。
    [0144] ( 以 下 余 白 ） 第 o 表 検 体 総な -ァミラ- f活性（a) P- Amy活性（b) b/a
    [0145] 患者血清
    [0146] NO (脖炎） 0.315 0.251 0.80
    [0147] GO (脬炎） 0.960 0.803 0.84
    [0148] N I (脬炎） 0.175 0.121 0.69
    [0149] SN (唾液腺炎） 0.870 0.023 0.03
    [0150] 健常人
    [0151] FO 0.175 0.055 0.31
    [0152] ON 0.146 0.061 0.42
    [0153] TH 0.130 0.041 0。32
    [0154] 第 3 表 に 示 す よ う に 、 総 - ア ミ ラ - ゼ に 対 す る P - A m y の 割 合 （ b ノ a ) は 、 脬 炎患 者 血 清 （ NO、 GO、 N I ) の 方 が 健 常人 よ り も 高 く 、 ま た 唾液 腺 炎患 者 （ SN) で は 逆 に 低 い 成積 が 得 ら れ た 産 業 上 の 利用 可能 _
    [0155] 本発 明 の 抗 P - A m y モ ノ ク ロ - ナ ル 抗体 は P - A m y と S - A m y と の 分 別 定量 に 有用 で あ る 。 血清 の 如 き ヒ ト 体 液 中 の P - A m y と S - A m y を 分 別 定量す れ ば 種 々 の 疾 患 、 特 に 脬疾患 の 診 断が で き る
    权利要求:
    Claims
    請 求 の 範 囲
    (1) 下 記 の 性 質 を 有 す る 抗 ヒ ト 脬 型 な - ア ミ 一 ゼ モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 ：
    <D ヒ ト 脬 型 な - ア ミ ラ - ゼ を 認 識 す る 、
    © 実 質 的 に ヒ ト 唾 液 型 な - ァ ミ ラ - ゼ を 認 識 し な い 、
    © 抗 原 た る ヒ ト 脾 型 - ア ミ ラ - ゼ と の 免 疫 反 応 後 に お い て も 該 酵 素 が 失 活 し な い 。
    (2) 不 溶 性 担 体 が 結 合 し た 請 求 の 範 囲 第 1 項 記 載 の 抗 ヒ ト 脬 型 な - ア ミ ラ ― ゼ モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 。
    (3) 不 溶 性 担 体 が 細 菌 細 胞 壁 片 で あ る 請 求 の 範 囲 第 2 項 記 載 の 抗 ト 脬 型 - ア ミ ラ - ゼ モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体
    (4) 不 溶 性 担 体 が ラ ク ト バ チ ル ス プ ラ ン タ ラ ム の 細 菌 細 胞 壁 片 で あ る 請 求 の 範 囲 第 2 ま た は 3 項 記 載 の 抗 ヒ ト 脾 型 な - ア ミ ラ - ゼ モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 。
    (5) 細 胞 融 合 技 法 に よ っ て 製 造 さ れ た 請 求 の 範 囲 第 1 項 記 載 の 抗 ヒ ト 脬 型 - ア ミ ラ - ゼ モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体
    (6) ① 検 体 に 請 求 の 範 囲 第 1 項 記 載 の 抗 ヒ ト 脬 型 α - ァ ミ ラ - ゼ モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 を 加 え て 免 疫 反 応 を 行 い ② 生 ず る 抗 原 抗 体 複 合 物 を 分 離 し 、 そ し て ③ 該 抗 原 抗 体 複 合 物 中 の - ア ミ ラ - ゼ 活 性 を 測 定 す る こ と か ら な る 検 体 中 の ヒ ト 脬 型 な - ァ ミ ラ - ゼ の 定 量 法
    (7) 不 溶 性 担 体 と 洁 合 し た 抗 ヒ ト 驿 型 α - ア ミ 一 ゼ - 2.2 - モ ノ ク ロ - ナ ル 抗体 を 用 い 、 抗 原 抗体複 合 物 の 分 離 を 遠 心 に よ り 行 う 請 求 の 範 囲第 6 項 記 載 の 定量法 。
    (8) 免疫反応 の 系 に 抗 ヒ ト 膊型 - ア ミ ラ - ゼ モ ノ ク 口 - ナ ル 抗体 に 対す る 抗体、 す な わ ち 第二抗体 を 作用 さ せ 、 生 じ る 複 合 物 を 遠心分 離 す る 請求の 範 囲 第 6 項記 載 の 定量法。
    (9) 不 溶 性担体 と 結合 し た 第二抗体 を 用 る 請求 の 範 囲 第 8 項記載 の 定 量法。
    (10) 不 溶 性担 体 が 細 菌細胞壁片 で あ る 請求 の 範囲 第 7 ま た は 9 項 記載 の 定 量法。
    (11) ① 検 体 に 請 求 の 範 囲第 1 項記載 の 抗 ヒ ト 脬型 α - ァ ミ ラ - ゼ モ ノ ク ロ - ナ ル 抗体 を 加 え て 免疫反応 を 行 い
    ②生 ず る 抗 原 抗体複 合 物 を 分 離 す る こ と か ら な る ヒ ト 脬 型 な - ア ミ ラ - ゼ と ヒ ト 唾液腺 型 な - ア ミ ラ - ゼ と の 分 離法。
    免 疫反応 の 系 に 抗 ヒ ト 脬型 な - ア ミ ラ - ゼ モ ノ ク 口 - ナ ル 抗体 に 対 す る 抗体、 す な わ ち 第二 抗 体 を 作用 さ せ 、 生 じ る 複 合 物 を 遠心分 離 す る 請求 の 範 囲第 11項 記 載 の 分 離法。
    (13) 不溶性担体 と 結 合 し た 第二抗体 を 用 い る 請求 の 範 囲 第 12項 記 載 の 分離法。
    m 少 く と も 不 溶性担体 と 結合 し た 抗 ヒ ト 脬型 - ア ミ ラ - ゼ モ ノ ク ロ - ナ ル 抗 体 を 含 む こ と か ら な る ヒ ト 脬 型 な - ア ミ ラ - ゼ と ヒ ト 唾 液腺型 - ア ミ ラ ニ ゼ と を 分 離 す る た め の 試 薬。 '
    09 少 く と も 抗 ヒ ト 脬 型 - ァ ゼ モ ノ ク ロ 一 ナ ル 抗体 お よ び ⑤ 不溶 性担体 と 結合 し た 第二抗体 を 含 む こ と か ら な る ヒ ト 脬型 な - ア ミ ラ - ゼ と ヒ ト 唾液腺 型 な - ァ ミ ラ - ゼ と を 分 離 す る た め の 試 薬。 '
    (19 キ ツ ト の 形 態 に あ る 請 求 の 範 囲 第 15項記 載 の 試薬
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